On fait d’abord migrer les protéines selon leur poids moléculaire

• Electrophorèse su gel SDS polyacrylamide de l’échantillon
• Transfert des bandes protéiques du gel par blotting sur une feuille de nitrocellulose ; recouvrir le gel avec une feuille de nitrocellulose et compresser le tout avec un objet pesant
• Saturer les sites de liaison inoccupés de la nitrocellulose avec de la caseine
• Incuber avec l’anticorps de lapin dirigé contre la protéine dirigé contre la protéine d’intérêt
• Laver puis incuber avec un anticorps secondaire anti-lapin et auquel est lié par … une enzyme facile à doser >> laver et mise en évidence de la protéine -> coloration

Conclusion :

Purifier une protéine : libérer la protéine de la cellule (solubilisation) puis mettre en oeuvre de façon séquentielle plusieurs techniques de séparation

Objectif de la purification : obtention d’une protéine de plus en plus pure pour étudier spécifiquement sa structure, sa fonction

Au cours du processus de purification, vérifier que la protéine ne soit pas dénaturée. A l’issue de la purification, dosage quantitatif de la protéine

Cas particulier des protéines sériques : étape de solubilisation n’est pas nécessaire

Méthode immunologique à 2 sites anticorps
Pour toute molécule de poids moléculaire suffisamment élevé : pour protéine ++, hormonologie
Le signal est proportionnel à la quantité d’antigène à doser
Différent types de marqueurs : colorimétrie, radiomarqué… (poly)