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Introduction
-> La GRH = C’est un ensemble de politiques, de pratiques mise en oeuvre dans une organisation pour :

• Identifier
• Acquérir
• Intégrer
• Organiser
• Développer
• Mobiliser

Les compétences individuelles et collectives en vues d’atteindre un objectif commun

• De cela en découle un certain nombre d’actions :
• L’évaluation des besoins
• Le recrutement
• La formation
• La mobilité
• La rémunération
• La santé, le bien-être au travail
• Le dialogue social et la communication

La RSE (= Responsabilité Sociale/sociétale de l’Entreprise) (exemple : réinsertion des personnes ayant subit un accident, écologie, tri-sélectif, etc… C’est un axe de plus en plus développé par les entreprises actuelles).

On fait d’abord migrer les protéines selon leur poids moléculaire

• Electrophorèse su gel SDS polyacrylamide de l’échantillon
• Transfert des bandes protéiques du gel par blotting sur une feuille de nitrocellulose ; recouvrir le gel avec une feuille de nitrocellulose et compresser le tout avec un objet pesant
• Saturer les sites de liaison inoccupés de la nitrocellulose avec de la caseine
• Incuber avec l’anticorps de lapin dirigé contre la protéine dirigé contre la protéine d’intérêt
• Laver puis incuber avec un anticorps secondaire anti-lapin et auquel est lié par … une enzyme facile à doser >> laver et mise en évidence de la protéine -> coloration

Conclusion :

Purifier une protéine : libérer la protéine de la cellule (solubilisation) puis mettre en oeuvre de façon séquentielle plusieurs techniques de séparation

Objectif de la purification : obtention d’une protéine de plus en plus pure pour étudier spécifiquement sa structure, sa fonction

Au cours du processus de purification, vérifier que la protéine ne soit pas dénaturée. A l’issue de la purification, dosage quantitatif de la protéine

Cas particulier des protéines sériques : étape de solubilisation n’est pas nécessaire

Méthode immunologique à 2 sites anticorps
Pour toute molécule de poids moléculaire suffisamment élevé : pour protéine ++, hormonologie
Le signal est proportionnel à la quantité d’antigène à doser
Différent types de marqueurs : colorimétrie, radiomarqué… (poly)

Poly
- Dite en défaut d’anticorps
- Tous les antigènes, quel que soit leur taille

SDS page

Les SDS
- Détergeant ionique qui rompt les liaisons non covalentes des protéines activés
- Se lie très fortement aux protéines en leur conférant une forme de baignoire
- Apporte une très forte charge électrique à la protéine

Séparation des protéines en fonction de leur masse moléculaire, par effet de filtration sur gel
La mobilité électro-phorétique de nombreuses protéines en gel de polyacrylamide de SDS est
inversement proportionnelle à leur masse

Application SDS page : détermination des … moléculaires
- De protéines normales
- Des sous unités de protéines désactivés par le SDS

Détection des bandes de gel +/- quantification par coloration
- Bleu de ccomessie
- Amidoschwartz
- Rouge ponceau

Intégration des bandes sèches au …
Application électrophorèse des protéines sériques
Pour immune-transfert = western blot (cf III 2)
Electrophorèse des protéines sériques : voir poly

II –

Les techniques immunochimiques sont très sensibles et spécifiques

Fondées sur la spécificité des Ac pour leurs protéines cibles
- Ac polydoneur
- Ac monodoneur

Principe : détection directement de la protéine en la faisant précipiter avec ces Ac ou indirectement

par dosage immunologique

- Introduction du gel dans une plaque verticale
- Dépôt des différentes solutions de protéines dans les puis de gel (en haut)
- Fermer la chambre du gel avec un couvercle
- Appliquer une différence de potentiel

La protéine chargée migre vers l’anode située dans la partie inférieure du gel

Dans électrophorèse sur gel la migration dépend
- De la charge de la protéine
- De sa taille
- Du support (gel plus ou moins réticulé, papier…)

Electrophorèse en gel = inverse de la filtration sur gel

Gel =billes de la filtration sur gel mais imperméable aux solutions protéiques. Les molécules les plus
petites se déplacent plus rapidement que les molécules les plus grosses

Séparation de solutés chargés par migration dans un champ électrique

Les protéines ionisées, donc chargées, placées dans un champ électrique se dirige vers l’électrode designe opposé à leur charge

La vitesse de migration est fonction
- De l’intensité du champ électrique
- De la charge globale de la protéine
- Du complexe de friction f / dépend de la masse de la molécule et de la viscosité ou non du
milieu (inversement proportionnel)
V = Ez/f

Repose sur la relative spécificité d’interaction d’une protéine pour certains ligands

- Injection de la solution protéique en haut de la colonne
- Liaison de la protéine d’intérêt au ligand
- Elution de la protéine d’intérêt

• Lavage avec une solution d’un composé qui a une plus forte affinité pour la protéine d’intérêt que le ligand
• Modification des propriétés de la solution pH, … force ionique, afin de déstabiliser le complexe ligand-protéine

Les protéines sont séparées selon leur taille et leurs formes
Phase stationnaire : billes de gel dont les pores laissent passer les petites molécules
Ex de gel : dextran (cephadex)
Agarose
Polyacrylamide

La phase stationnaire est un échangeur d’ions … par une résine porteuse de groupement ionisés négativement ou positivement ; exercent des interactions de type électrostatiques avec des solutés ioniques du milieu

Résine C+ + protéine chargé + résine-protéine chargé + + C+

Ex de résine : résine substitué par des groupements sulfonate (SO2…) résine échangeuse de cations

Le pHi est le pH isoélectrique d’une protéine c’est-à-dire le pH où la protéine a une charge nette nulle
- Une protéine a une charge + à pH<pHi
- Une protéine a une charge – à pH>pHi

Elle peut être retenue suivant le cas sur
- Un échangeur de cations (C+)
- Un échangeur d’anion (A-)

Echangeur d’anions (A-) = gel porteurs de charges fixes positives
Echangeuse de cation (C+) = porteurs de charges fixes négatives
Résine+A- + protéine- Résine+protéine- + A-
Echangeur d’A-

• Mise en solution de la protéine ou des AA dans une solution de pH et [sel] tels que la protéine est immobilisée sur l’échangeur d’ion choisi
• Injection de la solution en haut de la colonne
• Liaison des protéines ou AA à l’échangeur d’ion avec des affinités différentes
• Elution : lavage de la colonne avec des solution tampons de pH et de [sel] différente : plus l’affinité de la molécule pour l’échangeur est forte, plus sa migration est retardée